冻干皮上划痕用鼠疫活菌苗制造及检定规程

本品系采用鼠疫菌弱毒菌株，经培育后冻干制成。用于预防鼠疫。 1　菌种 1.1　菌种来源 用弱毒的EV菌株，由中国药品生物制品检定所分发或经同意。 1.2　菌种检定 冻干菌种在生产前每年需要检查一次培养特性、生化特性、噬菌体裂解试验及安全性。 1.2.1　培养特性 在琼脂平皿上，37℃培育44～48小时之菌落应为粗糙型，在肉汤中液面有薄菌膜，管底有沉淀物，肉汤透明。 1.2.2　生化特性 应分解葡萄糖，产酸不产气，石蕊牛乳轻度变红，在甘油培养基内不产酸不产气。 1.2.3　噬菌体裂解试验 将EV菌种涂于琼脂平皿上，加滴度为10-6以上的鼠疫噬菌体1滴，于28℃培育44～48小时，在噬菌体流过的地方应无本菌生长。 1.2.4　安全试验 用体重300～400g豚鼠3只，每只皮下注射120亿菌（28～30℃培育44～48小时的培养物）。在注射后第6天解剖1只，第21天解剖2只，检查注射部位、脾、肝、肺，并用脾、肝、肺及心血进行培育。其中心血和肺培育应无本菌生长。肉眼检查病变，注射部位可见充血，浸润变为脓疡，肝和脾可有丘疹状结节，肺部不应有鼠疫特异病变为安全试验合格。肺部如有显著病变时，应用同量豚鼠复试，若仍有显著病变时，菌种应废弃。 1.2.5　免疫力试验 用体得200～250g的豚鼠10只，每只皮下注射70万菌（28～30℃培育44～48小时的培养物）一次。于20～25天后进行攻击，每只皮下感染鼠疫强毒菌200个MLD。。同时用3组豚鼠作对照，每组3只，各组豚鼠皮下分别注射0.5、1及2个MLD的毒菌。免疫组及对照组至少观察25天。免疫动物存活不少于8只，而对照动物注射1个及2个MLD全部死亡时，免疫力试验为合格。 1.3　菌种保存 菌种应冻干保存，冻干菌种保存于2～8℃暗处。 2　菌苗制造 2.1　制造鼠疫活菌苗之实验室在生产期间应专用，不得作其他细菌工作，绝对禁止保存鼠疫毒菌。 2.2　制造用培养基 制造菌种可用pH6.8~　7.2的厚氏琼脂培养基或其他适宜的培养基。 2.3　原液制造 2.3.1　第1代菌种 启开干燥菌种加入生理盐水溶解后，接种于厚氏琼脂培养基上，于28～30℃培育44～48小时为第1代。放2～8℃保存可使用半个月。 2.3.2　第2代菌种 用生理盐水将第1工菌种洗下，接种足够量的种子瓶，于28～30℃培育44～48小时为第2代，供大批生产用。不得用第3代菌种生产。 2.3.3　大量接种 第2代菌种经肉眼检查无杂菌后，加入适量生理盐水洗下菌苔，制成均匀的菌悬液，用此菌悬液接种培养瓶，于28～30℃培育44～48小时后，逐瓶肉眼检查，有杂菌者废弃。 2.3.4　采集 用由蔗糖、明胶、硫脲、味精及尿素组成的保护液洗下菌苔（洗菌前将凝固水倒去）或将菌苔刮入上述保护液内，制成原液。每瓶原液均应按《生物制品无菌试验规程》进行纯菌试验，不得有杂菌生长。 2.3.5　合并、稀释、分装 用4层纱布或绢布将纯菌试验合格之原液过滤合并，按中国细菌浊度标准比浊后用保护液稀释，使稀释后每人份含菌数7亿～9亿。然后按10或20人份分装于安瓿，并进行冻干。采集至冻干，原液不得超过7天，合并后的原液应按《生物制品无菌试验规程》进行纯菌试验。 2.4　菌苗分批 同一日培育的原液于同一次冷冻干燥者为1批。如1批有数瓶，应分亚批。 3　冻干 菌苗分装后应立即在-30℃以下进行冷冻。干燥时间可根据水含量及活菌数来决定。干燥完毕后进行真空封口，亦可充氮封口。 4　成品检定 4.1　物理性状检查 本品为白色或淡黄色疏松体。用真空测定器检查安瓿应为真空。菌苗水分含量不得超过3%。加入生理盐水后应在半分钟内溶解成均匀悬液。 4.2　浓度测定 菌苗经稀释后，按中国细菌浊度标准（7亿/ml）测定浓度。皮上划痕用菌苗每人份含菌数为7亿～9亿。 4.3　活菌数测定 由生产部门会同质量检定部门进行。每亚批取3支安瓿，加生理盐水溶解后，混匀比浊，稀释至10亿/ml。再按10倍系列稀释至10-6。用10-6稀释度悬液接种5个平皿，每个平皿接种0.1ml。涂匀后放28～30℃培育2～3天，计算活菌数。冻干后活菌率不少于45%为合格。如低于45%时可复试，如仍不合格则该批菌苗应废弃。 4.4　纯菌试验 每批菌苗按《生物制品无菌试验规程》进行。 5　菌落、菌形检查 应呈典型粗糙型菌落，涂片镜检，为革兰氏阴性杆菌。 4.6　安全试验 由生产部门会同质量检定部门进行。每亚批菌苗取2支安瓿，用生理盐水溶解后，用体重300～400g豚鼠2只，每只皮下注射120亿菌，第6天称豚鼠体重（不应比原体重减轻1/5以上）并取其中1只解剖，另1只观察到21天解剖。检查项目及要求均同1.2.4项。 4.7　免疫力试验 每10批菌苗抽检，10批以下者每3～5年至少检查1次。由生产部门会同质量检定部门进行。用体重250～300g豚鼠10只，每只皮下注射5000万菌，注射后20～25天以200个MLD的鼠疫毒菌进行皮下攻击。同时有3组豚鼠作对照，每组3只，分别于各组豚鼠皮下注射0.5、1和2个MLD。各组动物于注射后，观察25天。免疫动物活存不少于8只，而对照动物注射1个和2个MLD全部死亡时，免疫力试验为合格。 5　保存与效期 应保存于2～8℃暗处。自冻干后活菌数检定合格之日起效期为1年。