附录1　人凝血因子Ⅷ效价测定（一步法）

1　试剂 1.1样品稀释液：取1容积的3.8%枸橼酸钠液加入5容积咪唑缓冲液。 1.1.1　咪唑缓冲液 称0.68g咪唑和1.17g氯化钠溶于100ml蒸馏水中，加入42.2ml　0.1mol/L盐酸，然后被　加入蒸馏水至200ml,pH为7.3。 1.1.23.8%枸橼酸钠溶液 称9.5g枸橼酸钠溶解于250ml蒸馏水中。 1.2　血小板代用品“兔（人）脑组织的氯仿抽提液”。用前用生理盐水稀释至适当倍数。 1.3白陶土生理盐水混悬液 称0.5g白陶土加生理盐水至100ml即可使用。 1.4　基质血浆 取人凝血因子Ⅷ含量低于2%的血友病病人血浆或人工基质血浆，然后分装于5ml安瓿，冻干或-30℃保存。 1.50.05mol/L氯化钙溶液 称111g氯化钙溶于1000ml蒸馏水中，配制成1mol/L氯化钙贮存液，用前进行20倍稀释，配成0.05mol/L氯化钙溶液。 1.6　人凝血因子Ⅷ标准品及标准血浆 人凝血因子Ⅷ国家标准品或经国家标准品标化的工作标准（定量分装冻干，置-30℃保存，一般2IU/ml左右），用前取样品稀释液溶解成1IU/ml。 标准血浆系取30份新鲜正常人血浆等量混合后，分装于小瓶内，置-30℃保存。自采血后至分浆冻结整个过程不得超过4小时。 1.7待测样品 按标示量加入注射用水溶解，测定时稀释成1IU/ml。 2　测定 2.1取2支试管，每管加入0.1ml基质血浆和0.1ml样品稀释液，混匀，再加0.1ml血小板代用品和0.1ml白陶土悬液，混匀，将试管置37℃水浴保温一定时间（一般2～6分钟），然后加入0.1ml0.05mol/L氯化钙溶液，记录凝固时间，2管平均值为基质血浆的“空白”值（一般应大于3分钟）。 2.2　标准品或标准血浆 用样品稀释液分别进行10倍、20倍、40倍、100倍和200倍稀释，用不同稀释浓度标准品代替2.1项试验中样品稀释液，按上述方法分别测定凝固时间。 2.3　待测样品稀释成约0.02～0.04IU/ml，代替2.1项试验中样品稀释液，同时分别测定凝固时间。 2.4测定时要求每个稀释度平行测定2管，两管之差不得超过均值10%，否则重测。 3　计算 将标准品5个不同稀释度所含人凝血因子Ⅷ单位（IU/ml），分别取其对数值，再将其各相应浓度所测得凝固时间（秒），也分别取对数值，然后按照统计学方法作直线回归方程。 方程式：log　y=b　olg　x+a 其中x代表人凝血固子Ⅷ单位数，y代表测得相应凝固时间（秒）。 将测试样品所得到凝固时间（秒）代入方程式计算x值。然后将所得x值乘以样品稀释的倍数，即为每ml中人凝血因子Ⅷ含量。